Sterilisasi dan Pembuatan Media

1.    Sterilisasi

Bekerja secara aseptik merupakan prinsip utama dalam aktivitas yang berhubungan dengan mikroba dan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam laboratorium mikrobiologi. Kesterilan ruangan, alat, dan bahan-bahan harus diperhatikan karena mikroba mudah tersebar dan dapat hidup dimana saja. Sehingga sebelum melakukan kegiatan di laboratorium sebaiknya dilakukan sterilisasi terlebih dahulu. Sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda.

2. Jenis-Jenis Sterilisasi

Terdapat tiga jenis sterilisasi yaitu:

·      Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.

·      Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran.

1) Pemanasan

a) Pemijaran atau pembakaran menggunakan bunsen dilakukan dengan cara membakar alat pada api secara langsung.

b) Panas kering merupakan proses sterilisasi yang menggunakan oven dengan suhu 60⁰-180⁰ C.

c) Uap air panas bertekanan menggunakan autoclave yang bekerja pada tekanan 1 atm dengan suhu 121⁰ selama + 15 menit.

2) Penyinaran

a) Sinar Ultra Violet (UV) juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Biological Safety Cabinet (BSC) atau Laminar Air Flow (LAF) dengan disinari lampu UV.

b) Sinar Gamma yang bersumber dari Cu60 dan Cs137 dengan aktivitas sebesar 50-500 kilo curie serta memiliki daya tembus sangat tinggi. Dosis efektifitasnya adalah 2,5 MRad. Gamma digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari logam, karet serta bahan sintesis seperti pulietilen.

·      Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan misalnya alkohol  karena alkohol bersifat racun terhadap sel pada konsentrasi yang relatif tinggi. Konsentrasi optimal alkohol yang digunakan dalam sterilisasi secara kimiawi antara 70% sampai 90%. Hal ini dikarenakan alkohol yang berkonsentrasi sangat tinggi, misalnya alkohol 100% tidak mampu menembus membran sel bakteri sehingga hanya mampu mendenaturasi protein di luar sel bakteri bukan di dalam sel bakteri yang merupakan target utamanya.

3. Media Pertumbuhan Mikroba

Proses  menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba memerlukan suatu subtrat yang disebut media. Media adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang diperlukan untuk menumbuhkan mikroba. Nutrisi yang dibutuhkan mikroba untuk pertumbuhannya meliputi karbon, nitrogen, unsur non logam seperti sulfur dan fosfor, unsur logam seperti Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, dan Fe, vitamin, air, dan energi. selain itu media pertumbuhan mikroba juga harus memiliki tekanan osmosis, pH, tegangan permukaan yang sesuai, tidak mengandung zat penghambat (inhibitor), dan steril.

4.    Jenis-Jenis Media

Media dapat digolongkan berdasarkan bentuk, komposisi, dan fungsinya.

·      Berdasarkan bentuk atau konsistensinya media terdiri dari:

a.  Media padat (solid medium) berbentuk padat, tidak mengandung agen cair.

b.  Media cair (liquid medium) berbentuk cair, media ini dapat berupa bahan organik alamiah (yang dibuat dari kentang, wortel), atau dapat juga berupa bahan anorganik (misal silica gel).

c.  Media semi padat (semi solid medium), media padat yang dapat dicairkan, apabila dalam keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya media agar.

·      Berdasarkan susunan komposisinya, media dapat digolongkan menjadi:

a. Media sintetik adalah media yang dibuat dari bahan yang jenis dan takarannya diketahui secara pasti.

b. Media semisintetik adalah media yang dibuat dari bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis serta diketahui sebagian komposisinya.

·      Berdasarkan fungsinya, media terdiri dari beberapa jenis, yaitu:

a. Media Pengaya adalah media yang ditambah zat-zat tertentu (misalnya: serum, darah,   ekstrak tanaman) sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu.

b. Media Khusus adalah media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan   kemampuannya untuk mengadakan perubahan kimia tertentu.

c.  Media Penguji adalah media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin-vitamin, asam amino, antibiotik dan sebagainya.

d.  Media Selekif adalah media yang ditambah zat-zat tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain. Misal: media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi pertumbuhan bakteri gram negatif.

e. Media Differensial adalah media yang diberikan bahan atau zat-zat tertentu sehingga  suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan untuk membedakan jenis-jenis mikroba

5.    Potato Dextrose Agar (PDA)

   Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan salah satu jenis dari media sintetik. Media PDA berfungsi untuk mengembangbiakkan atau menumbuhkan kapang dan khamir. Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan media yang terdiri dari dextrose, sari kentang, dan agar. Proses pembuatan media PDA yaitu sebanyak 5,25 gram bubuk PDA dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu ditambahkan aquades hingga 250 ml kemudian mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Selanjutnya larutan dihomogenkan dan dipanaskan dengan microwave atau hot plate stirrer hingga media tampak berwarna bening kekuningan. Setelah itu, media didinginkan lalu disterilisasi secara fisik dengan autoclave dengan suhu 121^oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Contoh mikroorgamisme yang ditumbuhkan pada media PDA yaitu  Pleurotus ostreatus, Saccharomyces cereviceae, Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus brasiliensis, Trichophyton mentagrophytes.

6.    Plate Count Agar (PCA)

Plate Count Agar (PCA)merupakan salah satu jenis dari media sintetik. Media PCA berfungsi yaitu  untuk mengembangbiakkan atau menumbuhkan semua jenis mikroba. Plate Count Agar (PCA) merupakan media yang terdiri dari hidrolisat enzimatik (5 gram), Yeast extract (2,5 gram), Dextrose (1 gram), dan Agar (15 gram). Proses pembuatan media PCA yaitu sebanyak 10 gram bubuk PCA dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu ditambahkan aquades hingga 250 ml kemudian mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Selanjutnya larutan dihomogenkan dan dipanaskan dengan microwave atau hot plate stirrer hingga media tampak berwarna bening kekuningan. setelah itu, media didinginkan lalu disterilisasi secara fisik dengan autoclave dengan suhu 121^oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Contoh mikroorgamisme yang ditumbuhkan pada media PCA yaitu Escherichia coli, Salmonella sp.,  Staphylococcus aureus, dll.

7.    Nutrient Agar (NA)

Nutrient Agar (NA) merupakan salah satu jenis dari media sintetik. Media NA berfungsi untuk mengembangbiakkan atau menumbuhkan bakteri. Nutrient Agar (NA) merupakan media yang terdiri Beef extract (1,5 gram), Yeast extract (1,5 gram), pepton (5 gram), Sodium Klorida (5 gram), dan agar (15 gram). Proses pembuatan media NA yaitu sebanyak 5 gram bubuk NA dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu ditambahkan aquades hingga 250 ml kemudian mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Selanjutnya larutan dihomogenkan dan dipanaskan dengan microwave atau hot plate stirrer hingga media tampak berwarna bening kekuningan. setelah itu, media didinginkan lalu disterilisasi secara fisik dengan autoclave dengan suhu 121^oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Contoh mikroorgamisme yang ditumbuhkan pada media NA yaitu Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Thypi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus casei, dll.

8.    Kentang Agar

Kentang Agar merupakan media semi sintesis yang berfungsi untuk menumbuhkan kapang dengan menggunakan kentang sebagai sumber nutrisi utama bagi mikroba. Komposisi kentang agar meliputi kentang, agar, dan glukosa. Walaupun sama-sama memiliki bahan dasar berupa kentang, kentang agar dan PDA berbeda. Perbedaannya terdapat pada kandungan gulanya dimana PDA memiliki kandungan gula yang lebih kompleks berupa dextrose dari kelompok monosakarida, sedangkan kentang agar memiliki kandungan gula yang lebih sederhana yaitu glukosa. Hal inilah yang menyebabkan PDA mampu menumbuhkan Khamir dan kapang sedangkan kentang agar hanya optimal menumbuhkan kapang. Proses pembuatan kentang agar yaitu buah  kentang yang telah dibersihkan dan dipotong-potong ditimbang hingga 230 gram dengan timbangan analitik. Kemudian, kentang dihaluskan dengan menggunakan blender dan ditambahkan aquadest hingga 500 ml. Selanjutnya, kentang yang telah dihaluskan disaring lalu, hasil saringannya dimasukkan ke dalam gelas ukur, kemudian dituang ke dalam erlenmeyer. Setelah itu,media dicampurkan dengan gula pasir dan agar. Kemudian media diaduk dengan menggunakan batang pengaduk lalu dihomogenkan dan dipanaskan menggunakan microwave hingga muncul buih pada media. Setelah itu media didiamkan beberapa saat lalu dimasukkan kembali kedalam  microwave hingga didapatkan larutan berwarna kuning pudar bening.Setelah media dingin, mulut erlenmeyer ditutup dengan menggunakan kapas dan aluminium foil. Setelah itu, pada tahap terakhir dilakukan sterilisasi fisik menggunankan autoclave dengan suhu 121⁰C  selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

9.    Tauge Agar

Tauge agar adalah media semisintetik yang berfungsi untuk menumbuhkan khamir. Kapang juga dapat tumbuh pada media ini namun pertumbuhannya tidak sebaik khamir. Komposisi tauge agar meliputi tauge yang berfungsi sebagai sumber vitamin, nitrogen organik, dan senyawa karbon, sukrosa yang berfungsi sebagai sumber karbohidrat penghasil energi, agar sebagai pemadat media, dan aquades berfungsi sebagai  pelarut untuk melarutkan sukrosa dan tauge. Proses pembuatan tauge agar yaitu tauge yang telah dibersihkan dan dipotong-potong ditimbang hingga 230 gram dengan timbangan analitik. Kemudian, dihaluskan dengan menggunakan blender dan ditambahkan aquadest hingga 500 ml. Selanjutnya, tauge yang telah dihaluskan disaring lalu, hasil saringannya dimasukkan ke dalam gelas ukur, kemudian dituang ke dalam erlenmeyer. Setelah itu, dicampurkan dengan gula pasir dan agar. Kemudian media diaduk dengan menggunakan batang pengaduk lalu dihomogenkan dan dipanaskan menggunakan microwave hingga muncul buih pada media. Setelah itu media didiamkan beberapa saat lalu dimasukkan kembali kedalam  microwave hingga didapatkan larutan berwarna kuning pudar bening. Setelah media dingin, mulut erlenmeyer ditutup dengan menggunakan kapas dan aluminium foil. Setelah itu,pada tahap terakhir dilakukan sterilisasi fisik menggunankan autoclave dengan suhu 121⁰C  selama 15 menit pada tekanan 1 atm.

Sumber:

Cahyani, V. R. 2014. Petunjuk Praktikum Mata Kuliah Mikrobiologi Pertanian. Surakarta: Universitas Sebelas Maret.

Cappuccino, J. G., dan  Natalie, S. (2014). Manual Laboratorium Biologi. Jakarta: EGC.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Bandung: Erlangga.

Ramona, Y., Kawuri, R., Darmayasa, I.B.G. 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum Program Studi Farmasi. Bali: Universitas Udayana.

Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhammadiyah Malang. Malang.

Zaetun, S. 2015.”Analisis Penurunan Kadar Alkohol Ditinjau Dari Lama WaktuPenyimpanan Alkohol Segabai Desinfektan Di Laboratorium Klinik”. Media Bina Ilmiah.9(1).