IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM

1.    Metode-Metode Pewarnaan

Secara umum, teknik pewarnaan mikroba dapat dikategorikan menjadi 3 jenis yaitu

·         Pewarnaan sederhana (simple strain) yang bertujuan untuk melihat bentuk dan morfologi sel

·         Pewarnaan diferensial (differensial strain) terdiri dari pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam yang bertujuan untuk membedakan jenis-jenis sel melalui perbedaan warna

·         Pewarnaan spesial atau khusus (pecial strain) yang digunakan untuk mewarnai bagian-bagian tertentu dari sel atau  mikroba yang sukar diwarnai dengan menggunakan teknik pewarnaan sederhana.

2.    Metode Pewarnaan Gram              

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris yang digunakan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram. Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel untuk mengikat zat warna dasar setelah pencucian dengan alkohol. atau dicuci dengan alkohol. Pewarnaan gram dilakukan dengan tujuan membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif berdasarkan perbedaan warnanya dimana apabila sel mikroba yang merupakan bakteri gram positif  akan berwarna ungu dan sel bakteri gram negatif akan berwarna merah. Pewarnaan gram dilakukan dengan cara pemberian pewarna primer yaitu kristal violet yang akan memberikan warna metil ungu pada mikroba, setelah itu pemberian iodin yang berfungsi memperkuat pengikatan warna oleh sel mikroba, selanjutnya proses dekolorisasi dengan alkohol, dan pemberian zat warna tandingan menggunakan safranin.

3.    Prosedur Pewarnaan Gram

-       Kaca preparat disterilkan dengan alkohol 70% lalu difiksasi

-       Jarum ose dipijarkan kemudian ditunggu hingga dingin, lalu mikroba diambil dari media lalu diratakkan di atas kaca preparat

-       Kaca preparat difiksasi

-       Diteteskan Larutan kristal violet sebanyak + 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit

-       Kaca preparat dibilas dengan aquades dan difiksasi

-       Diteteskan larutan iodin dan dibiarkan selama + 30 detik

-       Kaca preparat dibilas dengan aquades dan difiksasi

-       Diberi alkohol, lalu dibilas dengan aquades mengalir dan difiksasi

-       Diberi Larutan safranin diberikan selama 20 detik

-       Dibilas dengan aquades dan difiksasi

-       Kaca preparat diamati menggunakan mikroskop

4.    Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif merupakan bakteri yang dapat mempertahankan warna metil violet atau warna ungu. Hal ini disebabkan karena pori-pori dinding sel bakteri gram positif akan menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna metil ungu. Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu, struktur selnya tebal dan terdiri dari satu lapisan yaitu peptidoglikan yang tebal, mengandung asam tekoat, lebih resisten terhadap gangguan fisik, lebih rentan terhadap penicilin, dan mampu menyerap warna metil ungu. Contoh bakteri gram positif yaitu Lactobacillus casei, Staphylococcus aureus, Bacullis subtilis,dll.

5.    Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metil ungu namun dapat mempertahankan warna merah setelah diberi alkohol. Hal ini disebabkan karena penyusun utama lapisan dinding sel pada bakteri gram negatif adalah lapisan lipid dimana pada saat diberi alkohol lapisan lipid akan larut dan menyebabkan pori-pori pada bakteri gram negatif akan membesar, sehingga zat pewarna utama yaitu kristal violet yang telah diserap akan dilepaskan dan sel mikroba hanya dapat menyerap zat warna kedua yaitu safranin. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu, struktur selnya tipis dan terdiri dari tiga lapisan yaitu lipoporisakarida atau lipid, protein, dan peptidoglikan yang tipis, tidak mengandung asam tekoat, kurang resisten terhadap gangguan fisik, kurang rentan terhadap penicilin, dan tidak dapat menyerap warna metil ungu. Contoh bakteri gram negatif yaitu E. Coli, Pseudomonas, dll.

6.    Kristal Violet

Gambar 01. Kristal violet

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan gram sekaligus pewarna primer atau pewarna utama pada pewarnaan gram adalah kristal violet. Senyawa penyusun kristal violet yaitu etil alkohol, amonium oksalat, dan aquades. Pemberian kristal violet akan membentuk ikatan kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet yang tidak luntur dengan alkohol. Mekanisme kerja kristal violet dalam pewarnaan gram yaitu memberikan warna metil ungu pada mikroba baik bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

7.    Safranin

Gambar 02. Safranin

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan gram sebagai pewarna sekunder adalah Safranin. Zat warna ini akan memberikan warna merah pada mikroba yang kehilangan warna setelah diberi alkohol. Senyawa penyusun safranin yaitu safranin O, etil alkohol, dan aquades. Mekanisme kerja safranin berbeda pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, dimana penambahan safranin tidak menyebabkan perubahan warna pada bakteri gram positif, karena persenyawaan kompleks kristal violet dan iodin tetap terikat pada dinding sel sehingga menyebabkan warna merah muda safranin tertutupi oleh ungu gelap yang diserap sebelumnya oleh bakteri gram positif. Sedangkan pada bakteri gram negatif, penambahan safranin akan menyebabkan sel bakteri berwarna merah, karena persenyawaan kompleks kristal violet dan iodin larut ketika pemberian alkohol sehingga dinding sel hanya mengikat zat warna kedua.

8.    Alkohol

Gambar 03. Alkohol

Proses dekolorisasi atau pelunturan zat warna dalam pewarnaan gram dilakukan menggunakan alkohol. Namun, penggunaan alkohol pada bakteri gram negatif dan bakteri gram positif akan memberikan hasil yang berbeda mikroorganisme akan tetap berwarna ungu atau menjadi tidak berwarna. Hal ini dikarenakan pada bakteri gram positif alkohol akan menyebabkan dinding sel menjadi keras dan kaku serta pori-pori sel mikroba mengecil dan menyababkan sel mikroba dapat mempertahankan berwarna ungu dari kristal violet. Sementara itu, pada bakteri gram negatif alkohol akan melarutkan zat lipid yang merupakan penyusun dinding sel bakteri gram negatif dan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga zat warna yang telah diserap sel akan keluar.

9.    Aquades

Gambar 04. Aquades

Proses menghilangkan kelebihan zat warna pada mikroorganisme target setelah diberi zat pewarna seperti kristal violet, safranin, dan iodin dilakukan dengan aquades. Hal tersebut dilakukan agar zat warna yang ada disekitar mikroorganisme target dapat dihilangkan sehingga tidak menggaggu proses pengamatan. Selain untuk menghilangkan kelebihan warna, aquades juga berfungsi untuk mengatur tingkat ketebalan sel mikroba yang dioleskan pada kaca preparat dengan cara pengenceran.

10.              Iodin

Gambar 05. Iodin

Proses pengikatan warna oleh sel mikroba dalam pewarnaan gram dilakukan menggunakan larutan lugol atau iodin. Larutan iodin tersusun dari iodium, kalium iodida, dan aquadest. Bakteri gram positif  yang diberi iodin akan berwarna ungu karena sel bakteri akan mengikat kompleks zat warna kristal ungu iodin dan terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma mikroba sehingga mampu meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh mikroba.

11.  Fiksasi

Fiksasi merupakan suatu proses dalam metode pewarnaan gram yang bertujuan untuk merekatkan sel mikroba pada kaca preparat, mempertahan atau meminimalisasi perubahan  bentuk, ukuran, dan struktur sel dan jaringan, meningkatkan afinitas atau daya ikat zat warna, memperkuat sel-sel mikroba, dan mencegah otolisis sel atau pecahnya sel yang diakibatkan oleh enzim-enzim yang terkandung dalam mikroba. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara memanaskan preparat yang telah diberi kultur mikroba menggunakan bunsen.

Sumber:

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.

Gunarso, Wisnu. 1989. Bahan Pengajaran Mikroteknik. Institiut Pertanian Bogor. Bogor.

Karmana, Oman. 2008. Biologi. PT Grafindo Media Pratama. Jakarta.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Bandung.

Riswani. 2010. “Strategi dan Manajemen Pengelolaan Cadangan Pangan Nasional”. Prosiding Seminar Nasional, 13-14 Desember 2010. ISBN 978-602-98295-0-1.

Staf Pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi Revisi. Binarupa Aksara. Jakarta.

Wahyuningsih. 2008. Pengecetan Gram. Universitas Jendral Soedirman. Purwokerto.

Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode dalam Mikrobiologi. Universitas Muhammadiyah Malang. Malang.